DISEÑO DE PROGRAMAS EFECTIVOS DE CONTROL DE BOTRYTIS

Entre los principales problemas fitopatológicos de la uva de mesa de exportación, destacan las pudriciones asociadas a Botrytis, un patógeno de gran variabilidad genética por lo que es clave el diseño de programas efectivos de control que consideren el potencial de infección y el nivel de sensibilidad a los fungicidas base de las poblaciones.

Marcela Esterio Grez, Ing. Agr. Mg. Cs. Prof. Asociado Laboratorio de Fitopatología Frutal y Molecular. Universidad de Chile

Todo indica que los resultados económicos de la industria de la uva de mesa de exportación -la temporada 2023/24- son mejores que los obtenidos en temporadas anteriores. Esto gracias a situaciones coyunturales externas, tales como la disminución de la producción de fruta de guarda en USA, los problemas de producción en Perú y la disminución de valores de transporte marino, entre otras. En EEUU la oferta de uva disminuyo fuertemente y por lo tanto la ley de la oferta y la demanda jugó a nuestro favor, mejorando los precios.

PARA MANTENER BUENOS RESULTADOS EN EL FUTURO

Entre los principales problemas fitopatológicos que afectan la producción de uva de mesa de exportación, de Calidad, destacan las pudriciones asociadas a Botrytis y las ocasionadas por las podredumbres ácidas, complejo de hongos, bacterias y levaduras, más otros agentes bióticos como Drosophila spp., pájaros, etc.

Para un manejo exitoso de la pudrición causada por Botrytis, aparte de las prácticas culturales, del uso de antagonistas biológicos y productos naturales, es fundamental el control mediante fungicidas de síntesis; incluso en zonas en que aparentemente no se dan excesivas condiciones favorecedoras de infección, como puede ser el valle de Copiapó.

Botrytis es un patógeno que presenta una gran variabilidad genética y una gran capacidad de reaccionar rápidamente a las condiciones agroecológicas, pudiendo incluso cambiar durante la misma temporada. En el período de flor a cosecha pueden desarrollarse importantes cambios en la población de este patógeno fungoso; como que una población en que predominan aislados sensibles a determinada molécula pase a ser absolutamente resistente a esta molécula al momento de cosecha. Por el contrario, puede ser que un programa de control efectivo logre importantes incrementos de sensibilidad a ciertas moléculas.

**Porcentajes de infección de B. cinerea temporada 2023-2024: Thompson Seedless (RM) y Red Globe (RH)** **Figura 1.** Niveles de infección detectados en floración, pre y post aplicación de envero y pre y post aplicación de precosecha en Thompson Seddless (Región Metropolitana), con un programa inadecuado de Flor y en Red Globe (Región de O´Higgins), considerando en floración moléculas efectivas que inhiben la germinación conidial.

Otro aspecto clave y que siempre debemos considerar, son los periodos más críticos de infección. Estos son Floración, de inicio a término, y el período que va de Envero a Cosecha, aunque los dos son importantes, el más gravitante de estos periodos es sin duda Floración, porque definirá cuán importante será el nivel de pudrición final a cosecha.

Como ya hemos indicado, la Clave ahora es producir fruta con un sello distintivo: Uva de Mesa Sana y de Calidad. Para lograrlo es fundamental el diseño de programas efectivos de control de Botrytis considerando la condición potencial de infección, así como el nivel de sensibilidad a los fungicidas base de las poblaciones predominantes del patógeno.

NIVELES DE INFECCIÓN EN NUEVAS VARIEDADES

Durante las últimas tres temporadas hemos continuado analizando distintos aspectos asociados con un manejo más sustentable, sostenible y social de las pudriciones causadas por Botrytis y hemos podido corroborar la importancia de un programa adecuado en Floración y su incidencia en el resultado final (Figura 1). Por otro lado, hemos empezado a analizar niveles de infección en nuevas variedades v/s un par de variedades tradicionales. También hemos analizado el nivel de agresividad de aislados de botrytis resistentes a algunos de los fungicidas base de los programas de control (fenhexamid / fenpyrazamine y carboxamidas (boscalid)), en estas mismas variedades. El comportamiento detectado ha resultado bastante variable (Tesis Magister U. de Chile, B. Fica) (Figura 2 A, B y C).

**FIGURA 2 A, B y C: A) Virulencia diferencial de aislados de Botrytis cinerea mutantes resistentes a fenhexamid (Serina, Isoleucina**) v/s aislado sensible (B05.10) y control negativo (agua destilada y estéril), en 5 variedades de uva de mesa: Thompson Seedless, Red Globe, Timco, Autumn Crisp y Allison. (Bayas inoculadas con y sin heridas, mantenidas a 20°C y oscuridad continua, evaluadas a los 3 y 7 días post inoculación). **B) Virulencia diferencial de aislados de Botrytis cinerea mutantes resistentes a Boscalid (ARGININA, (H272R) y TYROSINA (H272Y)** v/s aislado sensible (B05.10) y control negativo (agua destilada y estéril), en 5 variedades de uva de mesa: Thompson Seedless, Red Globe, Timco, Autumn Crisp y Allison. (Bayas inoculadas con y sin heridas, mantenidas a 20°C y oscuridad continua, evaluadas a los 3 y 7 días post inoculación). **C) Virulencia diferencial de aislados de Botrytis cinerea mutantes resistentes a Boscalid (Histidina (P225H)** v/s aislado sensible (B05.10) y control negativo (agua destilada y estéril), en 5 variedades de uva de mesa: Thompson Seedless, Red Globe, Timco, Autumn Crisp y Allison. (Bayas inoculadas con y sin heridas, mantenidas a 20°C y oscuridad continua, evaluadas a los 3 y 7 días post inoculación). (Fuente: Tesis de Magíster U. de Chile, B. Fica).

Así mismo, hemos corroborado la importancia de elegir el (los) fungicida (s) más adecuado (s) para ser aplicados en los periodos críticos de infección. Asociado con ello, hemos podido reafirmar la importancia de realizar un monitoreo certero, rápido y oportuno, o sea, en Tiempo Real, del nivel de infección y del tipo de población de Botrytis predominante en un determinado Cuartel, Variedad y Predio, como soporte para el correcto diseño del Programa de Control.

RESISTENCIA ASOCIADA A UN CAMBIO GENÉTICO

Es importante repasar algunos conceptos relacionados a pérdida de sensibilidad a fungicidas de síntesis, o “Resistencia”, y cuál sería actualmente situación en Chile.

En primer lugar, recordar que la resistencia a determinada molécula fungicida está asociada a un cambio genético y que es, por lo tanto, heredable; fenómeno que puede ser más o menos estable dependiendo del lugar del genoma del hongo en que este cambio se produzca.

¿Cuáles son las consecuencias de este cambio conocido como mutación? Es una modificación estructural en el lugar o “blanco de acción” del fungicida en el hongo, o sea, en la proteína asociada, por lo que el fungicida no va a ser capaz de afectar al patógeno y la respuesta de éste al fungicida va a ser menor, traduciéndose con el tiempo en una pérdida de sensibilidad a esa molécula.

En la Figura 3 se presenta la línea de tiempo de reportes de resistencia detectada a distintos fungicidas a los que han sido sometidas las poblaciones de Botrytis, tanto en Chile como a nivel mundial.

Podemos señalar que -actualmente- los mayores problemas de control se generan por la pérdida de sensibilidad a dos de las familias de fungicidas que son la base de los programas de control, las hydroxyanilidas / aminopyarazolinonas (fenhexamid y fenpyrazamine, respectivamente), y las carboxamidas, particularmente la pérdida de sensibilidad a boscalid.

ES CLAVE CONOCER LAS MUTACIONES Y NIVEL DE DAÑO POTENCIAL

En primer lugar, es importante conocer las “mutaciones” de los aislados de Botrytis que están asociados a la pérdida de sensibilidad a estos fungicidas. Sí estos cambios generan o no un costo metabólico en el hongo y conocer -así mismo- el nivel de agresividad de este tipo de aislados. O sea, conocer el nivel de daño que pueden provocar estos aislados resistentes.

En el caso de fenhexamid y fenpyrazamine, en las poblaciones chilenas de botrytis, al igual que en el resto del mundo, los aislados resistentes presentaban tres mutaciones en una posición de la proteína blanco del hongo (enzima 3 keto reductasa), en la posición 412, en donde ocurría el reemplazo de Fenilalanina por Serina o por Isoleucina o por Valina (F412S / F412I / F412V).

De estos aislados, los dos primeros mutantes (F412S y F412I), son los más agresivos, en tanto que F412S es el detectado con mayor frecuencia en Chile. Es más, cuando se realizan programas de control anti-resistencia, con el fin de recuperar la sensibilidad a estas moléculas, es el cambio que más cuesta eliminar. Es importante señalar que, según nuestros estudios, la generación de resistencia a estos fungicidas no implica un costo metabólico extra para el patógeno. Es así que, en general, los aislados resistentes crecen y sobreviven al igual que los sensibles y el único tipo de mutante resistente que resulta afectado en el nivel de esporulación es el que presenta la mutación Valina (F412V) (Figura 4).

A esta información debemos agregar nuevos antecedentes, muy interesantes, pero en etapa de publicación, que señalan que la resistencia a estas moléculas en la población de botrytis en Chile no está solo asociada a mutaciones en la posición 412. Recientemente hemos detectado en poblaciones de aislados chilenos de Botrytis -recuperados desde uva de mesa- que presentan altos valores EC₅₀ a estas moléculas fungicidas, pero que no presentan mutaciones en la posición 412 y sí en otras zonas. Actualmente estamos estudiando estos resultados con más detalle (Memoria de Título U. de Chile, M. Carreño).

Figura 3. Línea de Tiempo. Primeros reportes de pérdida de sensibilidad a fungicidas de acción Botryticida en Uva de Mesa en Chile.

En el caso de los aislados de Botrytis resistentes a carboxamidas, el blanco de acción es la enzima Succinato Deshidrogenasa (SDH) y, generalmente, las mutaciones ocurren en la subunidad B de esa proteína (SDHB). Las mutaciones más frecuentes en Chile son las que ocurren en la posición 272 y en la 225 del gen asociado (SdhB). En la posición 272 el cambio puede darse de Histidina por Arginina (H272R), por Tyrosina (H272Y), por Valina (H272V), o por Leucina (H272L). En Chile, actualmente, las mutaciones más frecuentes en la posición 272, serían H272R y H272Y (Figura 5). En el caso de las mutaciones en la posición 225 del gen SdhB, las detectadas en Chile han sido el cambio de Prolina por Histidina (P225H), por Leucina (P225L) y por Valina (P225V); de estás la más frecuente en los aislados chilenos ha sido P225H (Figura 5).

Es importante señalar que cuando se presentan cambios en una posición, generalmente, no se presentan mutaciones en la otra posición. Solo en unos muy pocos aislados hemos detectado la presencia de ambas mutaciones en los mismos aislados (situación en estudio).

Sin embargo, otro aspecto importante es que los aislados resistentes a este grupo fungicida presentan costos metabólicos que afectan su desarrollo. Es así que los aislados resistentes a boscalid crecen menos que los sensibles y que la resistencia a otros fungicidas carboxamidas es diferencial. En ocasiones los mutantes presentan alta resistencia a boscalid y moderada resistencia a otras moléculas carboxamidas, o -incluso- alta sensibilidad a otras. Tal es el caso del mutante tyrosina, que es altamente resistente a boscalid, pero es hipersensible a fluopyram, por lo tanto, si en una población se

**Figura 4.** Principales cambios “Mutaciones” detectadas asociadas a pérdida de sensibilidad de Botrytis a fenhexamid y a fenpyrazamine en Chile y a nivel mundial. En los aislados chilenos solo el cambio de fenilalanina por valina en la posición 412 (F412V) presenta un costo metabólico (disminución de esporulación), y esa puede ser una de las razones de este aislado sea el que se presenta en menor frecuencia en Chile. Los aislados Serina (F412S) y los aislados Isoleucina (F412I) crecen, esporulan y forman esclerocios igual y en mayor cantidad que los aislados sensibles y son igual o más virulentos que los sensibles (Memoria de Título U. de Chile, M. Azócar).

presenta una alta frecuencia de estos aislados, la aplicación de formulaciones con esta última molécula sería altamente efectivas en el control.

LA IMPORTANCIA DE LOS ASPECTOS GENÉTICOS

¿De qué nos sirve conocer la composición de las poblaciones de Botrytis que predominan en nuestro predio?

Este conocimiento es muy importante para diseñar los Programas Óptimos de Control de la temporada, pero la información solo puede ser obtenida con un monitoreo suficientemente específico. Debe determinar, de manera oportuna, además del potencial de infección, el tipo y frecuencia de aislados del hongo que presentan menor sensibilidad a estas dos importantes moléculas- O sea, debe ser un método certero, de alta especificidad, basados en el uso de técnicas moleculares. Sin embargo, para que realmente entregue el resultado de manera oportuna y en tiempo real, el atributo fundamental es que pueda obtener esta información directamente desde el tejido vegetal. Es lo que logramos con la nueva técnica desarrollada e implementada por el Laboratorio de Fitopatología Frutal y Molecular de la Universidad de Chile, gracias al apoyo de la Fundación para la innovación Agraria (FIA), FEDEFRUTA F.G., Redagrícola, importantes empresas de agroquímicas, exportadoras de uva de mesa y el apoyo indirecto de UVANOVA. A esta técnica la denominamos “Check Fast Botrytis” (Figura 6).

**Figura 5.** Principales cambios “Mutaciones” asociadas a pérdida de sensibilidad de Botrytis a boscalid en Chile. En Chile en la posición 272 del gen SdhB, predominan los cambios de histidina a arginina(H272R) y de histidina a tyrosina (H272Y) y en la posición 225 el cambio de prolina a histidina (P225H). Los aislados con mutaciones en la posición 272 se presentan más en floración y los de la posición 225 en precosecha. Los tres tipos de aislados esporulan y producen más esclerocios que los sensibles, pero crecen menos que éstos aislados. Los mutantes más agresivos son P225H y H272Y. (Memoria de Título U. de Chile, M. Azócar).

El uso de este sistema de monitoreo permite posicionar la herramienta más adecuada de control para una población fungosa determinada y, lo más importante, es que solo a 48 horas desde que colectamos las muestras generamos y entregamos la información. Con este conocimiento un productor o asesor, puede definir hoy lo que debería aplicar mañana. La idea es aplicar lo justo y más efectivo para una población determinada.

La última temporada, con Check Fast Botrytis, hemos logrado en la misma temporada (de flor a cosecha), incrementos significativos en la sensibilidad de ambos tipos de fungicidas (fenhexamid / fenpyrazamine y boscalid) y disminuir los niveles de infección a cosecha (Figura 7).

¿CUÁNDO REALIZAR EL MONITOREO?

Para diseñar programas efectivos de control, lo ideal sería tomar muestras a inicio de floración con las primeras caídas de caliptras, para así conocer el potencial infectivo con que partiremos la temporada, así como determinar qué aplicar a inicio de floración, seleccionando el fungicida más efectivo según las características de la población de botrytis predominante. Por ejemplo, partimos con una carboxamida de última generación (fluopyram & pyrimethanil, isofetamida, adepidyn & fludioxonil), o con una mezcla efectiva, como cyprodinil & fludioxonil u otra que, según los monitoreos de condición de sensibilidad del predio, puedan presentar una eficacia comparable.

El otro momento es entre post envero y precosecha, para definir qué aplicar previo a cosecha, para asegurar una mejor llegada a destino.

**Figura 6.** Etapas de la técnica Check Fast Botrytis, que, en 48 horas, permite conocer el nivel de infección potencial de Botrytis y de la composición genotípica de las poblaciones predominantes a nivel local y diseñar óptimos programas de control para la misma temporada.

INFORMACIÓN PARA DEFINIR MERCADOS DE DESTINO

Esta técnica puede ser de gran ayuda para determinar el nivel de infección final (pudrición). Si no tenemos información inicial de infección potencial de botrytis en flor y ocurren eventos climáticos favorecedores de infección previo a cosecha, evaluar con esta técnica a cosecha nos puede ayudar a definir el mercado de destino de nuestra fruta, así como definir el tiempo de venta. O sea, ¿podemos guardar esta fruta esperando mejores precios o sería mejor no esperar mucho para evitar riesgos de pudriciones?

Con relación a los otros fungicidas base de los programas de control es importante señalar que los problemas de pérdida de sensibilidad son bastante menores, y el riesgo que se incrementen depende exclusivamente de la forma en qué los utilicemos.

El diseño de un programa estratégico de control, basado en la información que aporta este tipo de monitoreo, será de gran ayuda para producir Uva de Calidad. Sin embargo, debemos posicionar bien las moléculas fungicidas base registradas en los principales mercados de destino, porque podemos tener un alto nivel de sensibilidad a determinada molécula, pero que ésta no afecte los estados iniciales de infección, como es la germinación de conidias. Si así fuera, aunque la población sea sensible a esta molécula, al posicionarla en floración no vamos a tener un resultado exitoso.

**Figura 7.** Incremento de niveles de sensibilidad a fenhexamid y boscalid en la misma temporada, al aplicar programas de control efectivos diseñados según resultados de Check Fast Botrytis obtenidos al inicio de floración 2023-2024 (Lab. Fitopatología Frutal y Molecular U. de Chile). **Datos extrapolados desde frecuencia promedio de genotipos detectados en servicios Check Fast Botrytis realizados durante la Temporada 2023-2024**

Para producir Uva de Calidad, además de un monitoreo riguroso, certero, rápido y que entregue resultados de manera oportuna, debemos considerar muy bien los modos de acción de los fungicidas base que podemos aplicar, para posicionarlos en el momento época más adecuados a su accionar.